多發(fā)性硬化癥(MS)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)最常見的自身免疫性疾病。在MS病程中，持續(xù)的炎癥侵蝕神經(jīng)元，神經(jīng)變性和神經(jīng)功能障礙加劇。免疫抑制劑雖能有效調節(jié)MS患者CNS浸潤的免疫細胞，但不能干預進行性神經(jīng)變性。因此，臨床上仍需要直接作用于神經(jīng)元的神經(jīng)保護療法來干預MS和其他神經(jīng)退行性疾病中炎癥誘導的神經(jīng)變性。
對MS的廣泛研究闡明了浸潤的免疫細胞和CNS駐留的膠質細胞(特別是小膠質細胞和星形膠質細胞)在誘發(fā)慢性神經(jīng)炎癥中的重要作用。而神經(jīng)元通常被認為是神經(jīng)炎癥刺激的被動接收者，主要由于其免疫相關基因表達水平低，對炎癥刺激的形態(tài)變化和增殖能力有限。然而，最近逐漸認識到在神經(jīng)炎癥過程中，神經(jīng)元在感知到多種細胞因子或應激源后啟動神經(jīng)元炎癥應激反應(NISR)，從而主動參與神經(jīng)活動。
神經(jīng)元不僅被動地響應細胞因子以維持穩(wěn)態(tài)、協(xié)調發(fā)育，還能在炎癥環(huán)境中主動調節(jié)免疫反應。干擾素-γ（IFNγ)是MS和其他神經(jīng)退行性疾病CNS中高度富集的細胞因子，神經(jīng)元對IFNγ的反應表明神經(jīng)元積極參與CNS炎癥。IFNγ與神經(jīng)元上的Ⅱ型IFN受體結合，誘導STAT1表達和磷酸化，進而誘導干擾素應答基因（IRGs)。此外，IFNγ調節(jié)外周神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)中谷氨酸依賴性鈣電流，表明細胞因子信號可改變神經(jīng)元離子穩(wěn)態(tài)。然而IFNγ的作用方式、對NISR的貢獻、在炎癥性神經(jīng)退行性病變中的潛在作用仍未被探索。
除了細胞因子外，神經(jīng)炎癥期間的神經(jīng)元穩(wěn)態(tài)還受到神經(jīng)元離子失衡的挑戰(zhàn)。其主要原因是細胞外谷氨酸水平過高，其來源多樣，包括死亡細胞釋放谷氨酸，免疫細胞分泌谷氨酸活躍，神經(jīng)膠質細胞(尤其是星形膠質細胞)谷氨酸代謝受損。過量的細胞外谷氨酸導致興奮性毒性，這是由離子通道型谷氨酸受體激活后的細胞內鈣積累介導的，也可能是由內部儲存的鈣釋放介導的。這擾亂了神經(jīng)元鈣平衡，而鈣平衡是神經(jīng)元完整性、突觸功能和存活的關鍵決定因素。
與神經(jīng)元相反，免疫細胞等非興奮性細胞主要依賴于鈣庫操縱性鈣內流(SOCE)。這一過程起始于內質網(wǎng)(ER)上鈣釋放，促使內質網(wǎng)跨膜鈣傳感器蛋白——基質相互作用分子1和2(STIM1,STIM2)轉運到內質網(wǎng)和質膜之間的接觸位點。與鈣釋放-活化鈣(CRAC)通道（如ORAI鈣釋放-活化鈣調節(jié)劑1，ORAI1）聚集，使得鈣從胞外流入并隨后補充內質網(wǎng)儲存鈣。最近的研究發(fā)現(xiàn)，內質網(wǎng)鈣釋放也是神經(jīng)炎癥期間谷氨酸興奮毒性細胞死亡的關鍵因素。然而，盡管內質網(wǎng)鈣消耗(ERCa2⁺D)會加劇谷氨酸誘導的神經(jīng)元鈣積累，但其與炎癥信號級聯(lián)的相互作用以及CNS炎癥期間STIM易位對神經(jīng)元命運的影響仍不清楚。
2024年6月，來自德國漢堡-埃彭多夫大學醫(yī)學中心的Manuel A. Friese團隊在Cell上發(fā)表了題為“STING orchestrates the neuronal inflammatory stress response in multiple sclerosis”的研究文章。研究發(fā)現(xiàn)干擾素基因刺激因子(STING)作為炎性神經(jīng)元損傷的關鍵介質，關聯(lián)谷氨酸興奮性毒性、神經(jīng)元IFN信號傳導和細胞死亡，而干預神經(jīng)元STIM1-STING-GPX4信號可為多發(fā)性硬化癥相關的神經(jīng)退行性疾病提供新的治療方向。

圖解摘要

 

1.STIM1減輕炎癥引起的神經(jīng)變性

為了研究神經(jīng)元STIM蛋白是否參與CNS炎癥期間的神經(jīng)變性，作者構建了神經(jīng)元特異性缺失Stim1或Stim2的小鼠（Stim1-cKO/Stim2-cKO）。用MOG_35-55肽主動免疫小鼠構建實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)模型。Stim1-cKO(圖1A-B，S1A-B)而非Stim2-cKO(圖1C-D，S1C-D)顯示出病程加重，神經(jīng)元損失增加，突出表明STIM1是神經(jīng)元抵抗神經(jīng)炎癥所必需的。為了了解STIM1在神經(jīng)炎癥中的具體作用，作者首先表征了STIM1在EAE中的表達和亞細胞定位。在EAE小鼠皮層和接受腦活檢的MS患者(pwMS)的神經(jīng)元胞體中檢測到STIM1蛋白的顯著減少(圖1E-F)。這種減少不是由于轉錄調節(jié)，因為神經(jīng)元Stim1mRNA在EAE中沒有表達差異(圖1G)。由于神經(jīng)元的ERCa²⁺D在EAE動物和興奮毒性細胞死亡中顯著，作者假設EAE神經(jīng)元中SOCE的激活可能是突觸和軸突中STIM1水平代償性增加導致的。為了探討這一點，作者首先比較了急性和慢性EAE小鼠皮質突觸神經(jīng)小體中的STIM1蛋白水平(圖S1E)。有趣的是，慢性EAE模型突觸神經(jīng)小體的STIM1蛋白水平升高，而整個皮層的STIM1蛋白水平則降低(圖1H)。接著，作者分析了這些皮層運動神經(jīng)元到脊髓脊柱的軸突投射。軸突STIM1染色在急性和慢性疾病階段升高(圖1I，S1F)，支持了作者假設，即SOCE激活后突觸和軸突中STIM1增加。鑒于軸突中STIM1的增加可能反映了興奮性毒性損傷，作者接下來測試了STIM1是否優(yōu)先定位于受損軸突部位。為此，作者比較了健康軸突磷酸化(SMI31⁺)和受損軸突非磷酸化(SMI32⁺)神經(jīng)絲重鏈蛋白中的STIM1水平。事實上，與未損傷或恢復的SMI31⁺軸突相比，在慢性EAE期間，損傷的SMI32⁺軸突中STIM1水平明顯更高(圖1J，S1G)。值得注意的是，脊髓前角運動神經(jīng)元中Stim1mRNA和STIM1蛋白水平?jīng)]有差異(圖S1H-I)?？傊?，Stim1缺失增加了神經(jīng)元對炎癥性神經(jīng)變性的易感性。此外，CNS炎癥與神經(jīng)元細胞體中STIM1的顯著減少有關，這可能是由于STIM1易位到受損軸突或這些軸突中STIM1代償性增加。



圖1 STIM1缺失增加CNS炎癥中的神經(jīng)元易感性

 

 

圖S1 CNS炎癥影響神經(jīng)元STIM1的分布而不影響其表達

 

2.谷氨酸誘導的興奮性毒性激活SOCE

在證明STIM1減少或缺乏有助于EAE中炎癥誘導的細胞死亡后，作者在體外評估了ERCa²⁺D在興奮性毒性神經(jīng)元細胞死亡中的作用。使用不同的基因編碼鈣傳感器來監(jiān)測不同神經(jīng)元區(qū)室內谷氨酸誘導的鈣變化。內質網(wǎng)鈣耗竭的同時，谷氨酸興奮毒性通過ORAI增加胞質鈣水平和鈣內流（圖S2A-B)。同時，當神經(jīng)元暴露于谷氨酸時，STIM1⁺ER⁺ 樹突棘及STIM1⁺膜相關簇數(shù)量增加，靶向ERCa2⁺D亦是（圖S2C-F)。值得注意的是，與ERCa²⁺D相比，谷氨酸興奮毒性導致膜相關STIM1⁺簇與ORAI1共定位的顯著增加。通過補充鈣誘導SOCE，逆轉STIM1⁺ORAI1⁺簇，可通過CRAC通道抑制劑GSK-7975A來阻斷(圖S2G-I)。因此，ERCa²⁺D是神經(jīng)元對谷氨酸興奮毒性應激反應的一部分，導致STIM1重新定位至細胞膜，與ORAI1相互作用。

圖S2 谷氨酸興奮毒性激活神經(jīng)元中的SOCE

 

3.神經(jīng)元STING由SOCE激活

為了從機制上解釋Stim1缺失如何增加CNS炎癥期間神經(jīng)元的易感性，作者用谷氨酸刺激STIM1缺乏的皮層神經(jīng)元，并測量細胞存活率和胞質鈣積累。出乎意料的是，在缺乏Stim1的神經(jīng)元和WT神經(jīng)元之間，神經(jīng)元易感性無差異，所以炎癥環(huán)境可能是必需的(圖S3A)。為了驗證這一假設，將神經(jīng)元長期暴露于IFNγ中。與WT神經(jīng)元相比，這種炎癥暴露使Stim1缺失神經(jīng)元更容易發(fā)生興奮毒性細胞死亡(圖S3A)。谷氨酸誘導的胞質鈣變化并不能解釋其易感性差異(圖S3B)，這表明在Stim1-cKO EAE小鼠中觀察到易感性增加需要炎性誘導因子。
為了探索導致STIM1依賴性神經(jīng)元易感性的炎癥神經(jīng)元反應，作者對急性和慢性EAE Glt25d2-EGFP/L10a小鼠皮層運動神經(jīng)元的翻譯核糖體親和純化(TRAP)譜進行了測序(圖2A)。在急性和慢性EAE中最顯著誘導的神經(jīng)元基因之一是Sting1（圖S3C)，這是T細胞和成纖維細胞中STIM1的直接相互作用因子。STING是一種內質網(wǎng)跨膜蛋白，首次被報道為I型IFN對抗微生物感染的重要介質，在識別外源雙鏈DNA（dsDNA)后被環(huán)GMP-AMP合成酶(cGAS)激活。然而，其在神經(jīng)元中的表達和功能尚不清楚。此外，目前尚不清楚神經(jīng)元中是否存在STING激活的替代途徑。
有趣的是，在正常細胞培養(yǎng)條件下，無法檢測到原代神經(jīng)元中STING的表達。相比之下，長時間暴露于IFNγ后，STING表達被顯著誘導(圖S3D)，強調STING在炎癥神經(jīng)元中選擇性表達。通過對總皮質裂解物的免疫印跡證實了其在體內的誘導作用，在急性和慢性EAE中，STING及其活化磷酸化形式(pSTING)持續(xù)增加(圖2B)。這主要是由于神經(jīng)元STING和pSTING水平的增加，在慢性疾病階段達到峰值(圖2C，S3E)。相反，急性EAE期間，非神經(jīng)元細胞(特別是小膠質細胞)中STING和pSTING水平最高(圖S3F-G)。
接著，作者探討了經(jīng)典STING信號的下游效應物在EAE中的表達。其中，只有干擾素調節(jié)因子3（IRF3)在EAE小鼠皮層中表達上調，可能由于IRF3在小膠質細胞中表達。盡管通過免疫印跡(圖S3H)和免疫組化(圖S3I)檢測了IRF3、pIRF3、pTBK1和pNF-κB的神經(jīng)元表達，但慢性EAE期間無增加。且pIRF3、pNF-kB或pTBK在非神經(jīng)元細胞中不表達。以骨髓來源的樹突狀細胞(BMDCs)作為陽性對照，給予STING配DMXAA后顯著激活典型的STING信號通路(圖S3J)。因此，在CNS炎癥期間，經(jīng)典STING通路在皮層神經(jīng)元中不被誘導。
因此，作者假設在CNS炎癥期間，可能是神經(jīng)元細胞體中STIM1的耗竭(可能易位到受損軸突)導致神經(jīng)元中的STING激活。為了探究STING和STIM1是否存在相互作用，對STING過表達的Neuro-2a（N2a)細胞進行了免疫沉淀。內源性STIM1與EGFP標記的STING免疫共沉淀，表明STING和STIM1之間存在直接相互作用，ERCa²⁺D后這種相互作用顯著降低(圖2D)。在穩(wěn)態(tài)下，EGFP-STING與mScarlet-STIM1在內質網(wǎng)共定位(圖2E)，在DMXAA化學激活STING后（圖S3K)、ERCa²⁺D將STIM1易位至細胞膜(圖2E)或基因敲除Stim1(圖2F)后，STING轉移到高爾基體。由于鈣補充恢復了STIM-STING的共定位，因此SOCE可以調節(jié)STIM-STING的共定位，通過CRAC抑制劑GSK-7975A可抑制(圖2E)。ERCa²⁺D使得STING與STIM分離，STING磷酸化(圖2G)。此外，ERCa²⁺D或給予DMXAA或敲除Stim1增加了N2a細胞中的pSTING水平。值得注意的是，DMXAA并沒有進一步增強Stim1缺失N2a細胞中的pSTING(圖2H，S3L-M)，且pSTING主要定位于高爾基體(圖2I)。ERCa²⁺D誘導的STING磷酸化僅部分依賴于TBK1信號，因為TBK1抑制劑GSK-8612不能完全阻斷pSTING(圖S3N-O)。因此，神經(jīng)元ERCa²⁺D導致STING轉移至高爾基體，觸發(fā)其磷酸化。

圖S3 SOCE激活STING

 

4.神經(jīng)元中STING不誘導經(jīng)典通路

接著，作者探討了STING如何影響體外神經(jīng)元的活力。由于STING在穩(wěn)態(tài)下不表達，可使用慢病毒表達STING，或長時間暴露于IFNγ或慢病毒表達Ifng來誘導STING(圖S3D)。結果表明STING與STIM1在內質網(wǎng)共定位，并在靶向ERCa²⁺D、暴露于谷氨酸或DMXAA化學激活STING后共定位缺失(圖3A，S4A-B)。表達STING的神經(jīng)元和長期暴露于IFNγ的神經(jīng)元更容易受到谷氨酸興奮毒性的影響(圖3B，S4D)，可通過STING抑制劑C176或H151(圖3C-D，S4D)或Sting1缺失神經(jīng)元(圖3E)來挽救，而用STING激動劑吖啶酮乙酸(CMA)并不能進一步增強毒性（圖3C）。為了證實STING向高爾基體的易位是STING介導的易感性所必需的，對僅在ER保留表達STING(STING^ER)的神經(jīng)元開展相同實驗(圖S3K)，發(fā)現(xiàn)抑制了神經(jīng)元易感性的增加(圖3F)，未觀察到C176的保護作用或CMA的任何影響，強調STING轉運到高爾基體是增加神經(jīng)元易損性所必需的。同樣，在沒有STING表達的神經(jīng)元中，H151和C176都不能保護其免受興奮性毒性的影響，突出其特異性(圖S4D-E)。同樣，與WT神經(jīng)元相比，缺乏Stim1的神經(jīng)元對STING誘導的細胞死亡更易感，證實了STIM1在炎癥神經(jīng)元ER中駐留STING的重要作用(圖3G)。
為了了解STING介導的神經(jīng)元易損的分子機制，作者首先分析了經(jīng)典的STING信號通路。盡管ERCa²⁺D顯著誘導STING和TBK1的磷酸化，但pTBK1的水平在WT和Sting1-KO的N2a細胞中相似（圖S4F)。此外，與DMXAA處理的WT N2a細胞相比，Stim1-KO的N2a細胞顯示出更高水平的pSTING，但沒有激活STING的典型下游效應物(圖2H，S3L)。與BMDCs等免疫細胞相比，神經(jīng)元培養(yǎng)物在穩(wěn)態(tài)下可檢測到pTBK1、pIRF3和pNF-κB表達(圖S3J)。通過免疫印跡檢測，STING表達和暴露于DMXAA、poly(I:C)、谷氨酸或ERCa²⁺D，沒有進一步增加這種表達(圖S4G-H)。
同樣，暴露于RNA模擬poly(I:C)可誘導神經(jīng)元培養(yǎng)上清中Cxcl10和Ifi44的表達，而獨立于STING表達(圖S4I)，強調神經(jīng)元能夠誘導獨立于STING的IFN反應。為了驗證STING是否在體內激活經(jīng)典信號通路，作者首先分析了在WT和Sting1-cKO小鼠皮層中經(jīng)典STING信號下游靶點的蛋白表達。再次觀察到獨立于STING的pTBK1和pIRF3高表達(圖S4J)。通過免疫組化分析WT和Sting1-cKO小鼠EAE模型中的神經(jīng)元也觀察到這種現(xiàn)象(圖S4K)。作者從WT或Sting-cKO健康或EAE小鼠中分離神經(jīng)元核，比較Cxcl10、Ifi44和Ifnb的表達，與先前發(fā)現(xiàn)一致，EAE神經(jīng)元中轉錄上調，獨立于基因Sting1缺失(圖S4L)。因此，作者證明了在體外或體內，經(jīng)典的I型干擾素刺激途徑在穩(wěn)態(tài)下表達，并在CNS炎癥過程中進一步上調，但不依賴于STING。

圖3 STING增加神經(jīng)元對興奮性毒性的易感性

圖S4 經(jīng)典的STING通路在神經(jīng)元中未被激活

 

 

5.STING誘導神經(jīng)元自噬依賴性細胞死亡

由于經(jīng)典的STING信號通路在炎癥神經(jīng)元中不起作用，作者假設非經(jīng)典的STING信號通路發(fā)揮作用，如誘導自噬。自噬是降解未折疊蛋白質、受損細胞器和病原體所必需的細胞過程。自噬誘導自噬體形成，將其內容物轉運至溶酶體降解。雖然自噬是體內平衡和健康所必需的，但自噬改變逐漸被認為是衰老和多種疾病的誘因。STING介導的自噬通過促進病毒和細菌的清除來限制病原體感染。這一過程可獨立于TBK1激活和IFN誘導而發(fā)生。用ba?lomycin A1抑制溶酶體降解后對自噬泡進行染色，以評估表達STING(圖4A)或暴露于IFNγ的神經(jīng)元(圖4B和S5A)的自噬通量。通過谷氨酸興奮毒性，ERCa²⁺D誘導或DMXAA激活STING而誘導。事實上，導致神經(jīng)元中STING激活的每一種刺激都能誘導自噬，可通過H151或基因敲除Sting1來抑制(圖4C，S5B)。通過多種方式進一步證實了谷氨酸處理后表達STING或暴露于IFNγ的神經(jīng)元自噬增加（圖S5C-D）。此外，在表達STING的神經(jīng)元中，LC3-II/LC3-I比值升高(圖S5F)。但與經(jīng)典STING信號通路無關，因為使用TBK1抑制劑自噬通量無顯著變化（圖S5G)，而C端截短的STING^ΔCT突變體（不能與TBK1和IRF3相互作用）自噬通量增加(圖4D)。相比之下，LC3相互作用7基序(STING^LIR7)或WD重復結構域磷酸肌醇相互作用蛋白2（WIPI2;STING^W2BD）(兩者是STING-LC3相互作用所需)的缺失突變體中檢測到較少的自噬通量(圖4D)。但在表達STING^W2BD的神經(jīng)元中，谷氨酸誘導的自噬通量明顯高于表達STING^LIR7的神經(jīng)元，表明除了WIPI2之外，STING誘導的神經(jīng)元自噬還需要其他因素。
此外，Stim1缺失神經(jīng)元的STING依賴性自噬進一步增加（圖4C,4E,S5H-L)。給予雷帕霉素后自噬通量和最大自噬能力的基線水平在所有條件下均相似（圖S5M-N）。為了評估STING依賴性自噬中從內質網(wǎng)釋放STING的必要性，將表達STING的神經(jīng)元與表達STING^ER的神經(jīng)元相比較。發(fā)現(xiàn)表達STING而非STING^ER的神經(jīng)元中，p62⁺ puncta（自噬小體）增加（圖S5O)。以上數(shù)據(jù)表明，神經(jīng)元中非經(jīng)典自噬STING通路被激活。

為了檢驗增加的自噬通量是否誘導STING介導的神經(jīng)元對谷氨酸的易感，使用了各種自噬抑制劑處理表達STING的神經(jīng)元。事實上，抑制劑3-methyladenine、ba?lomycin A1、SAR405（SAR)和SBI0206965（SBI)在WT(圖4F-G，S5P-R)和Stim1缺失神經(jīng)元(圖4H-I)中逆轉了STING誘導的神經(jīng)元易感性。在沒有STING表達的情況下，這些抑制劑不影響神經(jīng)元的活力，也不為缺乏Sting1的神經(jīng)元提供額外的保護(圖5S)。此外，STING^ΔCT的表達增加了神經(jīng)元對谷氨酸的易感性。當神經(jīng)元表達STING^W2BD時，易感性顯著降低，而表達STING^LIR7的神經(jīng)元不存在該現(xiàn)象，藥理學上抑制TBK1時易感性加劇(圖S5T-U)。這共同表明，在炎癥條件下，ERCa²⁺D激活的STING通過誘導自噬來放大神經(jīng)元損傷。

圖4 STING激活神經(jīng)元中自噬依賴的細胞死亡

 

圖S5 抑制自噬可防止STING誘導的神經(jīng)元損傷

 

6.STING誘導的自噬通過降解GPX4激活鐵死亡

自噬依賴性細胞死亡的兩種不同機制已經(jīng)在癌細胞中被描述，而在神經(jīng)元中尚未被探索。自噬可以激活Na⁺/K⁺-ATP酶依賴性細胞凋亡，即自體死亡autosis。然而，使用ouabain阻斷Na⁺/K⁺-ATP酶(圖S6A)或使用pan-caspase抑制劑Z-VAD-FMK（圖S6B)并不能逆轉表達STING的神經(jīng)元對谷氨酸易感性增加。這表明autosis不是STING誘導的神經(jīng)元自噬依賴性細胞死亡的原因。

因此作者專注于第二種機制：鐵死亡，一種鐵依賴的細胞死亡途徑。這一途徑通過谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4)的自噬降解在癌細胞中被顯著誘導。GPX4可防止脂質過氧化并與鐵死亡有關。暴露于谷氨酸后，神經(jīng)元細胞體和樹突中的GPX4水平迅速下降，表達STING的神經(jīng)元中GPX4下降水平明顯高于STING^ER(圖5A，S6C)。可用STING抑制劑H151和自噬抑制劑SAR和SBI部分挽救(圖5B-C)。在谷氨酸興奮毒性誘導STING表達的神經(jīng)元中，GPX4⁺LC3⁺斑點表明GPX4陽性的自噬體數(shù)量增加，說明自噬驅動GPX4降解。該作用被藥理學抑制STING或自噬所逆轉(圖5D)。在過表達STING的神經(jīng)元中，GPX4的基線水平?jīng)]有差異;在對照或表達STING^ER的神經(jīng)元中，H151、SAR或SBI也沒有挽救谷氨酸誘導的GPX4減少(圖S6D-E)。此外，其他已知的鐵死亡關鍵調節(jié)因子，長鏈?；o酶A合成酶4（ACSL4），溶質載體家族成員（SLC7A11），鐵死亡抑制蛋白1（FSP1），在穩(wěn)態(tài)或谷氨酸刺激后表達沒有差異(圖S6F-H)。這些結果表明，在炎癥和興奮性毒性作用下，STING可以誘導神經(jīng)元中GPX4的自噬降解。
接下來，作者探討了GPX4自噬降解在神經(jīng)元中的功能相關性。首先，測量了氧化型谷胱甘肽(GSSG)和總谷胱甘肽(GSH)的比值。GPX4活性決定性地調節(jié)GSSG/GSH比值，因為GPX4通過將兩分子還原型GSH氧化為GSSG而將磷脂氫過氧化物還原為相應的脂醇。谷氨酸暴露增加了GSSG/GSH比率(圖5E)，降低了總GSH水平(圖S7A)，證明了興奮毒性谷氨酸應激下神經(jīng)元中GPX4的酶活性。但在表達STING的神經(jīng)元中，谷氨酸刺激后GSSG/GSH比值不再增加(圖5F)，表明GPX4活性降低。給予神經(jīng)元H151、SBI或SAR以及抗氧化劑去鐵胺后，GSSG/GSH比值恢復(圖5G)。在表達STING的神經(jīng)元中，基線GSSG/GSH相當，并且谷氨酸誘導的總GSH降低不受神經(jīng)元STING表達的影響(圖S7B-E)。與對照或表達STING^ER的神經(jīng)元相比，在谷氨酸暴露后，表達STING的神經(jīng)元表現(xiàn)出更高的ROS水平(圖5H,S7F)。STING^ΔCT顯著增加ROS產(chǎn)生，而表達STING^W2BD的神經(jīng)元中ROS少得多(圖5I)，進一步證實了獨立于經(jīng)典的STING途徑。H151、SBI和SAR以及鐵螯合劑去鐵胺和輔酶Q10(CoQ10)和鐵抑素處理可以挽救ROS的產(chǎn)生，但TBK1抑制劑GSK-8612則不能（圖5J，S7G-J）。因此，STING通過GPX4的自噬降解干擾炎癥神經(jīng)元的適應性抗氧化反應。由于Gpx4缺失導致鐵死亡激活，作者假設STING在炎癥誘導的神經(jīng)元鐵死亡中發(fā)揮關鍵調節(jié)作用。在WT（圖5K-L，S7K-L）和Stim1缺失神經(jīng)元（圖S7M-O）中，用抗氧化劑去鐵胺、CoQ10和鐵抑素處理可保護表達STING的神經(jīng)元免受谷氨酸興奮毒性的影響。因此，STING是神經(jīng)炎癥中神經(jīng)元自噬依賴性鐵死亡的關鍵調節(jié)因子。
由于無法確定是否需要穩(wěn)態(tài)cGAS活性來產(chǎn)生低水平cGAMP，從而持續(xù)驅動STING運輸和信號傳導，作者探索了cGAS是否也參與谷氨酸誘導的STING介導的神經(jīng)元鐵死亡。作者構建了缺失Cgas的神經(jīng)元（圖S8A），并通過慢病毒轉染或慢性暴露于IFNγ誘導STING表達。在表達STING的神經(jīng)元中，谷氨酸興奮毒性誘導的自噬通量增加（圖S8B）、GPX4降解（圖S8C-D）和ROS產(chǎn)生（圖S8E）在WT和缺失Cgas的神經(jīng)元中是相似的。不表達STING的cGAS缺陷神經(jīng)元對谷氨酸興奮毒性的敏感性較低，表明在沒有STING的情況下，cGAS在神經(jīng)元中具有明顯的生理作用（圖S8F）。因此，由谷氨酸興奮性毒性引起的STING誘導的鐵死亡可能不依賴于神經(jīng)元中的cGAS。

圖5 STING調節(jié)炎性神經(jīng)元的鐵死亡

 

圖S6 STING不調節(jié)ACSL4、FSP1和SLC7A11的表達

 

圖S7 神經(jīng)元STIM1缺失增加STING激活的鐵死亡

圖S8 STING誘導的鐵死亡與神經(jīng)元中的cGAS無關

 

7.STING抑制改善炎癥誘導的神經(jīng)變性

由于GPX4在pwMS和EAE神經(jīng)元中下調（圖S9A），作者探索了抑制STING作為治療MS神經(jīng)變性的治療策略。首先，作者分析了pwMS大腦神經(jīng)元STING的表達。與EAE類似，在進展性MS患者的正?；屹|（NAGM）皮層神經(jīng)元以及復發(fā)緩解型MS患者和活動性炎癥患者的皮層神經(jīng)元STING表達上調（圖6A）。鑒于STING在神經(jīng)元的廣泛上調，將其定位為治療干預的預期靶點，使用STING拮抗劑C176或H151治療EAE動物。從發(fā)病開始每日治療可降低臨床疾病評分（圖6B，S9B-C），減少神經(jīng)元丟失（圖6C）。用STING拮抗劑治療的小鼠顯示出較低水平的自噬標志物LC3（圖S9D）和鐵死亡標志物4-HNE(圖6D)，神經(jīng)元中GPX4表達增加（圖6E）。相比之下，Stim1-cKO EAE小鼠顯示較低的GPX4水平和較高的LC3和4-HNE水平，支持自噬依賴性鐵死亡在缺乏STIM1時加?。▓DS9E-G）。因此，藥理STING拮抗劑可減少炎癥誘導的神經(jīng)元鐵死亡。
然而，正如STING能誘導小膠質細胞強激活那樣，作者發(fā)現(xiàn)經(jīng)治療的EAE小鼠中激活的小膠質細數(shù)量減少（圖S9H）。為了繞過STING拮抗劑對小膠質細胞活化的抑制作用，作者在神經(jīng)元特異性的Sting-cKO小鼠上構建了EAE。結果表明Sting-cKO小鼠病程改善（圖6F，S9I-J），神經(jīng)元數(shù)量增加（圖6G），免疫熒光結果表明神經(jīng)元LC3（圖S9K）和4-HNE（圖6H）表達下調，GPX4水平上調（圖6I）。且沒有觀察到WT和Sting-cKO EAE小鼠小膠質細胞和CNS浸潤免疫細胞的數(shù)量存在差異（圖S9L，S10A-B）?？偟膩碚f，作者的數(shù)據(jù)表明抑制STING是在神經(jīng)炎癥條件下直接干預NISR的杰出治療范例，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

圖S9 STING增加EAE的神經(jīng)元自噬

圖6 STING抑制劑可防止炎癥誘導的神經(jīng)變性

圖S10 WT和神經(jīng)元Sting-cKO小鼠在EAE過程中表現(xiàn)出相似的免疫細胞浸潤和激活